Le diagnostic de botulisme repose sur l'identification de la toxine Clostridium botulinum en laboratoire et sur l'observation de symptômes cliniques, même s'ils sont parfois non spécifiques. En fait, la maladie peut être confondue avec le syndrome de Guillain-Barré, la polio, les accidents vasculaires cérébraux, la myasthénie grave et la paralysie des tiques.
Dans le botulisme alimentaire, le tableau des troubles neuromusculaires et l’ingestion d’aliments potentiellement contaminés sont des indices importants. La manifestation simultanée chez au moins 2 patients qui ont mangé le même aliment simplifie le diagnostic. La confirmation est obtenue en isolant le micro-organisme par culture d'échantillons d'aliments suspects ou de selles du patient et en identifiant la toxine botulique dans des aliments ou du matériel biologique (tels que le sang, le suc gastrique et les vomissements).
En revanche, dans le botulisme de plaie, la recherche de toxine sérique ou l'isolement de Clostridium botulinum à partir d'un échantillon de la lésion cutanée confirment le diagnostic.
